مقدمه ای بر اصل و کاربرد اجزای عمومی اسپکتروفتومتر

اسپکتروفتومتر به طور گسترده در تحقیقات بیولوژیکی ، شیمیایی ، بالینی و محیطی مورد استفاده قرار می گیرد.
اسپکتروفتومتری با عبور دادن پرتوی از نور از طریق نمونه در یک طیف سنج ، چقدر نور می تواند جذب کند.
با اندازه گیری شدت نور تشخیص داده شده می توان از این روش برای تعیین غلظت املاح در نمونه استفاده کرد.
مفهوم اسپکتروفتومتری
پرتو ارسال شده به نمونه از پرتو فوتون تشکیل شده است.
هنگامی که فوتونها با مولکولهای موجود در نمونه ملاقات می کنند ، مولکولها می توانند مقداری از آنها را جذب کنند ، تعداد فوتونهای موجود در پرتو را کاهش داده و شدت سیگنال تشخیص را کاهش دهند.
انتقال بخشی از نوری است که از طریق نمونه عبور می کند. به عنوان شدت نور عبور از نمونه در شدت نور حادثه تعریف می شود.
میزان جذب برخلاف میزان اندازه گیری شده توسط اسپکتروفتومتر است.
با توجه به جذب ، غلظت نمونه محلول را می توان از طریق لایحه قانون لامبرت تعیین کرد ، که نشان می دهد بین جذب و غلظت نمونه رابطه خطی وجود دارد. طبق قانون آبجو لامبرت ، جذب محصول ضریب جذب است ، این یک اندازه گیری از میزان نور جذب شده توسط املاح در طول موج معین و مسافتی است که از آن عبور می کند. نمونه ، یا فاصله سفر ، و غلظت املاح. به طور کلی ، هدف از اندازه گیری میزان جذب ، اندازه گیری غلظت نمونه است.
اجزای طیف سنج
هر طیف سنج از یک منبع نور ، یک کولیساتور (لنز یا وسیله تمرکز برای انتقال پرتوهای قوی و مستقیم) ، یک مونوکروماتور برای جدا کردن تیرها با طول موج های مختلف و یک انتخابگر طول برای انتخاب موج یا شیار از طول موج مورد نظر تشکیل شده است. طول موج نور مورد استفاده در اسپکتروفتومتر ارائه شده در این فیلم در محدوده نور ماوراء بنفش و مرئی است. اسپکتروفتومتر همچنین دارای یک نگهدارنده نمونه ، یک دستگاه عکسبرداری و صفحه نمایش است که نتایج حاصل از ردیاب را نشان می دهد.
جدیدترین اسپکتروفتومتر مستقیماً به یک کامپیوتر وصل می شود که در آن می توان پارامترهای آزمایشی را کنترل کرد و نتایج نمایش داد.
اصل کار اسپکتروفتومتر
هنگام انجام اسپکتروفتومتر ، بسته به نوع محلول بیولوژیکی یا شیمیایی مورد استفاده ، اقدامات احتیاطی نظیر پوشیدن دستکش مهم است.
دستگاه را روشن کنید و قبل از اندازه گیری طیف UV-Vis نمونه ، لامپ و الکترونیک را گرم کنید.
یک نمونه خالی از همان محلول را با همان pH و قدرت یونی مشابه آماده کنید ، اما بدون اینکه اجزای مورد بررسی قرار گیرند. از آنجا که کویت و حلال می توانند نور را پراکنده کنند ، تجزیه و تحلیل نمونه لازم است.
دارنده نمونه اسپکتروفتومتر سنتی برای نگهداری کاسه های پلاستیکی و کوارتز طراحی شده است. محلول اصلی را درون یک کاسه پیپت کنید.
بعد از پاک کردن هرگونه اثر انگشت و پاشیدن آنها در قسمت بیرونی کاسه ، قایق را به درستی داخل نگهدارنده نمونه وارد کرده و درب درب را ببندید.
هرگز درب را ببندید زیرا تابش اشعه ماوراء بنفش ناشی از اسپکتروفتومتر باز می تواند به چشم و پوست شما آسیب برساند.
طول موج یا طول موج مورد نظر را که به نمونه منتقل می شود ، برنامه ریزی کنید. این بستگی به بهترین طول موج که مؤلفه مورد تجزیه و تحلیل می تواند جذب کند. سپس دستگاه با اندازه گیری نمونه خالی صفر می شود که به دلیل برخورداری از بافر نمونه ، میزان جذب پایین را کاهش می دهد.
بسته به نوع آزمایش اسپکتروفتومتری که انجام می دهید ، ممکن است لازم باشد قبل از اندازه گیری نمونه ، یک منحنی استاندارد تولید کنید ، از این رو می توان غلظت ترکیب آنالیز شده در نمونه را تعیین کرد.
اجازه دهید نمونه به دمای مناسب برسد و به آرامی مخلوط شود تا از وارد شدن حباب ها جلوگیری شود. سپس می توان نمونه را مستقیماً به کاسه داخل دستگاه اضافه کرد و امکان خواندن نیز وجود دارد.
پس از اندازه گیری نمونه برای جذب ، آزمایش به درستی محاسبه می شود. به عنوان مثال ، برای تعیین غلظت یا سطح فعالیت آنزیم.
کاربرد اسپکتروفتومتر
یکی از کاربردهای رایج اسپکتروفتومتر اندازه گیری تراکم سلول است. اندازه گیری چگالی سلول می تواند برای تولید منحنی رشد لگاریتمی باکتریها مورد استفاده قرار گیرد که از این طریق می توان زمان بهینه برای ادغام پروتئین نوترکیب مشخص کرد.
از اسپکتروفتومتر نیز می توان برای اندازه گیری سرعت واکنش شیمیایی استفاده کرد. در این تجسم ، از جذب برای نظارت بر واکنش آنزیمی استفاده می شود ، که با گذشت زمان از طریق واکنش واسطه ای 452 نانومتر از بین می رود. میزان این مرحله آنزیمی را می توان با مطابقت داده ها با معادله مناسب محاسبه کرد.
معرفی میکرو اسپکتروفتومتر نیاز دارنده نمونه را از بین می برد. این اسپکتروفتومترها از تنش سطحی برای حفظ نمونه استفاده می کنند.
میکروسفکتروفتومتر بهترین انتخاب برای اندازه گیری جرم و غلظت نمونه های کوچک و گران قیمت مانند زیست مولکول ها از جمله پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک است.
جذب پروتئین ها در 280 نانومتر به میزان وابستگی زنجیره های جانبی معطر موجود در تریپتوفان ، تیروزین و فنیل آلانین و همچنین پیوند دی سولفید بین دو سیستئین بستگی دارد.
غلظت پروتئین را می توان با جذب آن در 280 نانومتر و ضریب جذب آن تعیین کرد که این امر بر اساس ترکیب اسیدهای آمینه است.
DNA و RNA حداکثر میزان جذب در 260 نانومتر را دارند که از این طریق می توان غلظت آنها را تعیین کرد. خلوص اسیدهای نوکلئیک را نیز می توان از نسبت قرائت جذب به طول موج خاص ارزیابی کرد.