کوانتومیت پروتئین طیف سنجی رنگی
پروتئین ها معمولا ترکیبی از پروتئین هستند. تست های کلریمتری بر اساس ترکیبات پروتئین است: اسیدهای آمینه (مثلا تیروزین، سریین) با یک گروه کروژنوژن دیگر یا رنگ برای تولید ماده رنگی واکنش نشان می دهند. غلظت مواد رنگی به طور مستقیم به تعداد اسیدهای آمینه مربوط به پروتئین واکنش نشان می دهد، در نتیجه منعکس کننده غلظت پروتئین است.
روش رنگ سنجی
روش های متعددی مانند BCA، Bradford و Lowry وجود دارد.
روش Lowry: بر اساس اولین واکنش بیوره و بهبود یافته است. پروتئین با Cu2 واکنش نشان می دهد تا واکنش آبی ایجاد کند. با این حال، روش Lowry حساسیت بیشتری نسبت به بیورت دارد. ناکارآمدی این است که نیاز به چندین واکنش مختلف را اضافه کنید. واکنش طولانی مدت طول می کشد؛ حساس به مواد غیر پروتئینی است؛ پروتئین حاوی EDTA، Triton x-100 و آمونیاک سولفات برای این روش مناسب نیستند.
آزمون Bicinchoninine اسید: این یک آزمایش پروتئینی جدید و حساس تر است. پروتئین مورد بررسی با Cu2 در محلول قلیایی واکنش داده می شود تا Cu تولید کند که کلات با BCA را تشکیل می دهد تا یک ترکیب بنفش با پیک جذبی در 562 نانومتر تشکیل دهد. رابطه خطی بین غلظت این ترکیب و پروتئین قوی است، و ترکیب تشکیل شده پس از واکنش بسیار پایدار است. نسبت به روش Lowry، عملیات ساده است و حساسیت بالا است. با این حال، شبیه به روش Lowry، حساس به دخالت پروتئین ها و مواد شوینده است.
روش برادفورد: اصل این روش اینست که پروتئین با Coomassie Brilliant Blue واکنش می دهد تا یک ترکیب رنگی که در 595 نانومتر جذب می شود تولید کند. بزرگترین ویژگی آن حساسیت آن است که 2 برابر لوری و BCA است. ساده تر و سریع تر است. این فقط یک نوع واکنش واکنش نیاز دارد. این ترکیب می تواند برای یک ساعت یک بار پایدار باشد تا نتیجه را تسهیل کند. در مواجهه با Lowry، BCA با عوامل کاهش دهنده (مانند DTT، Mercaptoethanol) واکنش نشان می دهد. با این حال، هنوز به مواد شوینده حساس است. اشکال اصلی این است که استانداردهای مختلف می توانند به تفاوت های زیادی در نتایج یک نمونه و نتایج قابل مقایسه ای منجر شوند.
برخی از محققانی که برای اولین بار در معرض اندازه گیری های رنگی قرار می گیرند ممکن است با نتایج آزمایش های مختلف رنگ سنجی اشتباه گرفته شوند. به نظر شما چه نوع روش هایی اشتباه گرفته می شود؟ با توجه به این واقعیت که گروه ها به شیوه های مختلف واکنش داده و گروه های کروموژنیک یکسان نیستند، همزمان چندین روش برای ایجاد غلظت نمونه از یک نمونه غیر سازگار استفاده می شود. به عنوان مثال، Keller و همکاران. پروتئین را در شیر انسانی آزمایش کرد و دریافت که غلظت های لوری و BCA به طور معنی داری بیشتر از برادفورد بود. تفاوت معنادار بود. حتی اگر همان نمونه تعیین شود، نمونه استاندارد انتخاب شده با روش مشابه با رنگ سنجی ناسازگار است، و غلظت بعد از آزمون نیز متناقض است. به عنوان مثال، از Lowry برای آزمایش پروتئین در هموگلوبین سلولی استفاده کنید، با استفاده از BSA به عنوان استاندارد، با غلظت 1.34 mg / ml و گلوبولین به عنوان یک استاندارد با غلظت 2.64 mg / ml. بنابراین، قبل از انتخاب یک روش رنگ سنجی، ترجیح می دهیم به ترکیب شیمیایی نمونه مورد آزمایش بپردازیم و پروتئین استاندارد شیمیایی مشابه استاندارد را پیدا کنیم. علاوه بر این، روش رنگ سنجی برای تعیین مقدار پروتئین اغلب مشکلات را ایجاد می کند زیرا مقدار جذب نمونه بسیار کم است و منجر به اختلاف زیادی بین غلظت نمونه اندازه گیری شده و غلظت واقعی می شود. مسئله کلیدی این است که رنگ بخش مهمی از اسپکتروفتومتر 1011، کوتوله نیمه عمر خاصی دارد، بنابراین هر یک از روش های رنگی، زمان آزمون آزمایش واکنش را نشان می دهد. تمام نمونه ها (از جمله نمونه های استاندارد) باید در این زمان آزمایش شوند. اگر زمان بیش از حد طول می کشد، مقدار جذب بدست آمده کوچکتر می شود و مقدار غلظت تبدیل شده کاهش می یابد. علاوه بر این، درجه حرارت واکنش، pH مقدار محلول و غیره، همه عوامل مهم در آزمایش هستند. علاوه بر این، استفاده از رنگ سنجی پلاستیکی بسیار مهم است. اجتناب از استفاده از کوتوله های ساخته شده از کوارتز یا شیشه ای زیرا رنگ پس از واکنش باعث ایجاد رنگ کوارتز یا شیشه می شود و جذب نادرست نمونه را ایجاد می کند.
این شرکت متخصص در فروش اسپکتروفتومتر است ، به مشتریان خوش آمدید که نیاز به مشاوره و خرید دارند، ما به شما خدمات صادقانه و کیفیتی، و همچنین قیمت پایین تر ارائه می دهیم.
پست الکترونیکی: info@sumerlab.com